Существующая неблагоприятная экологическая ситуация в стране представляет большую опасность для здоровья людей. В последние десятилетия в крупных городах и промышленных центрах резко возрастает загрязнение атмосферы из-за все увеличивающегося количества выбросов, которые на сегодня составляют около 400 кг на человека в год. До 27 % всех вредных промышленных выбросов приходится на долю теплоэлектростанций и котельных, работающих на угле. От 25 до 50 % (в крупных промышленных центрах) составляет в общем загрязнении доля автотранспорта. В выхлопных газах автомобилей содержится до 200 наименований ядовитых соединений, наиболее опасными из которых являются окись углерода и соединения свинца. В результате промышленных выбросов (в том числе и автотранспортом) в окружающую среду поступает больше, чем при естественном круговороте: ртути – в 8700 раз, мышьяка – в 125 раз, урана – в 60 раз и т.д. Растет запыленность [1, 2, 4, 5]. Необходимо учитывать также, что при воздействии солнечной радиации на смесь углеводородных газов и окислов азота, выбрасываемых в атмосферу с выхлопными газами, образуется так называемый «фотосмог». Все это в целом сказывается на состоянии здоровья людей и особенно негативное влияние антропогенная нагрузка оказывает на иммунную систему человека [2, 6]. Исследование иммунного статуса населения требует больших денежных затрат, персонала и длительности исполнения анализа. Поэтому проведение исследований требует наличия в арсенале практических лабораторий простых, доступных и чувствительных методов экспресс-диагностики, позволяющих оперативно исследовать большое число анализов.

По сочетанию критериев доступности и быстроты получения результатов, реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) с эритроцитарными диагностикумами (ЭД) является наиболее удобным тестом и имеет ряд ценных преимуществ: пригодность для массовых обследований при наблюдении за динамикой выработки антител, экономичность метода, большая чувствительность и специфичность, которые можно контролировать с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (такой контроль повышает достоверность получаемых результатов).

Основная цель разработки «ЭД», это выбрать такое технологическое решение, которое способствовало бы созданию высокочувствительного и стабильного при хранении диагностического препарата.

Трудности при получении эритроцитарных диагостикумов возникают от сложности выбора конъюгирующего (связывающего) агента способного активизировать один из компонентов [3]. В то же время, вещества, обычно используемые для связывания иммуноактивных частиц с поверхностью эритроцита (глутаровый альдегид, хлорид хрома, гидрохинон, амидол) не обеспечивают воспроизводимой чувствительности и стабильности тест-систем при хранении. Довольно часто наблюдаются явления спонтанной агглютинации эритроцитов.

Применение низкомолекулярных веществ для конъюгации основано на образовании одиночных ковалентных (глутаровый альдегид, гидрохинон, амидол) или координационных (хлорид хрома) связей между сенсибилизирующим белком и поверхностью эритроцита. При этом реакция контролируется кинетическими факторами, образующиеся связи достаточно прочны. В этом случае система «эритроцит – белок» оказывается в термодинамически неравновесном состоянии, при хранении таких ЭД происходит постепенное изменение конформаций макромолекулярных целей, что обуславливает нестабильность свойств таких эритроцитарных диагностикумов.

В то же время, как отмечено в ряде работ и в наших исследованиях, многие синтетические полимеры при взаимодействии с белками образуют равновесные комплексные соединения за счет множественных водородных и ионных связей. Отличительной особенностью таких систем является сочетание прочности и термодинамической природы взаимодействия, причем одна молекула синтетического полимера может взаимодействовать с несколькими белками. В связи с этим были проведены исследования по изучению эффективности антигенной сенсибилизации эритроцитов барана с помощью синтетических конъюгирующих компонентов: ПАК – полиакриловая кислота, ПМАК – полиметакриловая кислота, ПВТ – поли-5-винилтетразол, ПВИ – поли-1-винилимидазол, NX₂ – сополимер метакриловой кислоты с 1-винил-4,5,6,7-тетрагидроиндолом и метилметакрилатом. В качестве антигенов использовали: микробный антиген клеточной стенки коринебактерий дифтерии (видовой белок 64 кД – вакцинный вариант), бифедобактерин (B. Bifidum 1.791) и лактобактерин (L. Fermentum 90 ТС4) коммерческие лечебные препараты.

При сенсибилизации эритроцитов с выше указанными антигенами в присутствие синтетических полимеров учитывались степень полимеризации и концентрация полимеров, объемное соотношение взвеси эритроцитов, антигена и раствора полимера.

Чувствительность эритроцитарного диагностикума во многом зависит от концентрации конъюгирующего компонента. Так на примере (ПМАК – полиметакриловой кислоты с М.М. = 1000 кД) и концентрация полимера 0,2–0,8 мг/мл показана высокая чувствительность диагностикума по определению антибактериальных антител.

Повышение или понижение концентрации полимера не увеличивает чувствительность диагностикума, но повышает вероятность спонтанной агглютинации эритроцитов.

Были подобраны оптимальные условия для эффективной сенсибилизации эритроцитов с антигенами, определяющие основные характеристики эритроцитарного диагностикума: чувствительность, специфичность, воспроизводимость и стабильность. Сравнительная характеристика приготовленных диагностикумов проведена в параллельных опытах на примере ПМАК-1000 кД и хлорида хрома (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость диагностического титра антибактериальных антител от связывающего компонента (ПМАК 1000 кД и хлорид хрома), 1 – диагностикум на антибактериальные антитела к «КД», 2 – на антитела к бифидобактериям, 3 – к лактобактериям.

Сопоставление активности диагностикумов указывает на существенно большую чувствительность эритроцитарных диагностикумов с использованием полимерной кислоты, активность таких диагностикумов увеличивается в 2-8 раз по сравнению с использованием CrCl₃. (рис. 2, 3)

Рис. 2. Сравнительная характеристика диагностикумов на основе полиметакриловой кислоты (ПМАК) и хлорида хрома при определении антител к бифидобактериям.

Рис. 3. Сравнительная характеристика диагностикумов на основе полиметакриловой кислоты (ПМАК) и хлорида хрома при определении антител к лактобактериям.

Как показали дальнейшие исследования, чувствительность эритроцитарного диагностикума увеличивается с ростом степени полимеризации полимеров (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость диагностического титра антибактериальных антител к КД от природы и молекулярной массы полимерной кислоты (концентрация полимера равна – 0,8мг/мл).

Чем выше молекулярная масса полимера для сенсибилизации эритроцитов антигенами, тем выше чувствительность эритроцитарного диагностикума, так при М.М. ПАК-200, средний log₂ титра антител к КД составляет (3,5 ± 0,36), тогда как при М.М. ПАК-2000 средний log₂ (6,0 ± 0,58), такая же зависимость отмечена и для ПВТ.

Введение некоторого количества гидрофобных групп в цепь полимера существенно повышает стабильность образующихся на его основе интерполимерных комплексов. Так при переходе от ПМАК к сополимеру метакриловой кислоты с 1-винил-4,5,6,7-тетрагидроиндолом и метилметакрилатом (NX₂), при использовании их в качестве конъюгирующего компонента показана высокая активность ЭД при концентрации сополимера NX₂ равной 0,04 мг/мл.

Диагностикум приготовленный с конъюгирующим компонентом ПВИ – поливинилимидазолом при концентрации 0,01 мг/мл также имеет высокую активность, титр антител (1:128 – 1:256).

Как показали проведенные исследования, все испытанные конъюгирующие компоненты способны активно взаимодействовать с белками. Для каждого полимера характерна своя степень полимеризации (М.М.) и концентрации, обеспечивающие максимальную чувствительность диагностического препарата. Наибольшая активность эритроцитарных диагностикумов отмечена при использовании в качестве конъюгирующих компонентов ПМАК со степенью полимеризации Р = 1000 с концентрацией – 0,8 мг/мл, ПВИ – с концентрацией 0,01 мг/мл и сополимера NХ₂ с концентрацией 0,04 мг/мл. Во всех случаях при использовании диагностикумов с их применением отмечена высокая агглютинация сывороток – 1:640 – 1:1280 в РПГА, а при использовании CrCl₃ титр специфических антител довольно низок – 1:80

В проведенных исследованиях отмечена высокая стабильность таких эритроцитарных диагностикумов при хранении с добавлением консерванта азида натрия, жидкие эритроцитарные диагностикумы сохраняют свою активность в течение трех лет (срок наблюдения) при t = 3–6°, диагностикумы приготовленные с амидолом и гидрохиноном течение 5 месяцев, а CrCl₃ – 3 месяца.

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые показана возможность использования водорастворимых полимеров в качестве связующих агентов при сенсибилизации эритроцитов с антигеном в технологии изготовления эритроцитарных диагностикумов. Высокая чувствительность, воспроизводимость и стабильность диагностикумов на основе карбоксил- и азолсодержащих полимеров существенно расширяет границы применения метода РПГА. Данный метод может применяться для скрининговых иммунологических исследований и определять группы риска, подлежащие полному иммунологическому обследованию.

С.И. Лещук, В.В. Анненков, С.М. Попкова, Л.В. Сердюк

Литература

1. Галазий О.В. Анализ экологической обстановки и ее влияние на здоровье населения Иркутской области // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск, 2001. – № 4 (18). – С. 7–11.
2. Суржиков В.Д., Олещенко А.М., Суржиков Д.В. и др. Здоровье человека и факторы окружающей среды в индустриальных городах // Гигиена и санитария. – 2003. – № 5. – С. 85–87.
3. Каральник Б.В. Эритроцитарные реагенты в клинической иммунологии // Иммунология. – 1995. – № 7. – С. 4–6.
4. Маринайте И.И., Горшкова А.Г. Мониторинг полициклических углеводородов в снежном покрове Южного Прибайкалья (результаты 5 лет работы) // Третья Верещагинская Байкальская конференция: Тез. докл. – Иркутск, 2000. – 150 с.
5. Белых Л.И., Горшков А.Г., Рябчикова И.А., Серышев В.А., Маринайте И.И. Распределение и биологическая активность полициклических ароматических углеводородов в системе «источник — снежный покров – почва – растение» // Сибирский экологический журнал. – 2004. – № 6. – С. 793–802.
6. Савилов Е.Д. Техногенное загрязнение окружающей среды – новая детерминанта в развитии инфекционных болезней и заболеваемости // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск, 2001. – № 4 (18). – С. 5–7.